Les avancées majeures en biologie ont souvent été liées à des innovations technologiques importantes. Les technologies de séquençage haut débit (HTS, High-Throughput Sequencing) sont sans aucun doute l’une des inventions les plus importantes de ces dernières années, impactant entre autres et de façon majeure la découverte de nouveaux virus. Les HTS permettent de caractériser sans a priori le virome d’un échantillon, soit l’ensemble des virus présents. Néanmoins, l’avènement des HTS n’a été possible que grâce aux progrès des outils d’analyse bio-informatique permettant d’exploiter les données de séquençage massif. La présente Thèse a été réalisée dans le cadre d'un réseau de formation Marie-Curie nommé « INEXTVIR – Innovative Network for Next Generation Training and Sequencing of Virome » qui a pour but de mieux comprendre les communautés virales et leur rôle dans les écosystèmes agricoles, en utilisant les dernières avancées en matière de HTS. L’objectif central de cette thèse a été de déterminer la composition du virome de plusieurs espèces de Prunus afin d'identifier les virus, connus ou nouveaux, qui le composent, de caractériser certains d'entre eux et de développer des outils de diagnostic. Afin de maximiser la diversité génétique au sein des espèces de Prunus ciblées, le virome de 300 accessions provenant d’espèces cultivées ou apparentées,conservées dans le Centre de Ressources Biologiques (CRB) Prunus d’INRAE a été analysé. Ainsi, des accessions de Prunus armeniaca (abricotier), P. persica (pêcher), P.domestica (prunier), P. avium (cerisier doux), P. cerasus (cerisier acide), et d’espèces apparentées ont été soumises à un indexage par HTS. Des Prunus sauvages ou ornement aux collectés au gré d’autres études ont également été analysés. Pour cela, les ARN doubles brins, proxy d’une infection virale par des virus à ARN, ont été purifiés puis analysés. Au delà des virus classiquement connus pour infecter les espèces du genre Prunus, quatre nouveaux virus appartenant au genre Luteovirus, ont été mis en évidence chez divers Prunus : pêcher, abricotier, cerisier acide, abricotier du Japon (P. mume), un cerisier ornemantal (P. incisa) ou une espèce sauvage P. mahaleb. Par ailleurs, une recherche de séquences virales dans les bases de données Prunus a permis de reconstruire le génome d’un autre lutéovirus infectant potentiellement une espèce sauvage, Prunus humilis. Avant cette étude, seulement trois luteovirus étaient connus pour infecter les Prunus.L’identification et la caractérisation de ces cinq nouveaux luteovirus représentent donc une avancée importante dans la connaissance de ces agents. Une étude menée à l’échelle européenne a permis de montrer que les trois luteovirus (dont un nouvel agent) infectant le pêcher étaient très largement répandus avec des taux de prévalence importants, corroboran les données obtenues au sein de la collection de pêchers du CRB Prunus. Des essais de transmission de ces trois luteovirus à l’indicateur biologique GF305, ainsi que l’observation des arbres du CRB infectés suggèrent que ces virus n’induisent très vraisemblablement pas de symptômes significatifs, ce qui expliquerait qu’ils soient passés inaperçus jusqu’à présent, en dépit de leur très large distribution. Par ailleurs, la séquence génomique complète de quatre virus de la famille des Secoviridae a été déterminée au cours de ce travail, dont un nouveau Cheravirus identifié et caractérisé dans deux espèces sauvages (P.mahaleb et P. brigantina) et dans une accession d’abricotier. Des tests de détection par RTPCR performants ont été développés pour chacun des nouveaux virus étudiés.Globalement, ces travaux d’exploration du virome des Prunus ont permis d'enrichir notre connaissance des virus infectant cette famille et d'apporter de nouveaux éléments permettant de commencer à évaluer les risques potentiellement liés à ces différents agents.Ils ouvrent de nouvelles perspectives de recherche pour rendre compte de leur impact.